阳性信号的缺失是抗体相关实验中常见的问题，例如WB实验中暴露后膜上出现空白，需要根据具体情况进行分析
1、 确认样本中检测目标的表达
一般来说，常见的蛋白质可以在基因注释查询网站BioGPS上搜索。然而，应该指出的是，该网站列出了在转录水平上与编码蛋白质相对应的基因的表达水平。该表达水平可能与翻译产生的实际蛋白质水平不同，只能用作参考。当可检测时，可以通过增加抗体的稀释浓度来改善低表达水平的蛋白质。
分泌蛋白在正常表达过程中分泌到细胞外，细胞内残留的蛋白质含量相对较低。在这种情况下，建议使用含有蛋白质的阳性样本（如组织）作为对照进行比较，以确定蛋白质含量低还是抗体具有特异性。
磷酸化蛋白质以及一些蛋白质需要药物刺激才能在样品中高度表达。在这种情况下，客户可能没有阳性样本，需要提供参考作为解释。我们将根据参考文献中的具体报告来确定问题。有时，客户可能会忽略文献中样品的处理步骤，从而导致反馈。
2、 样品制备问题
尽管冻融样本通常可以复制，但仍然有蛋白质（如小分子蛋白质、分泌性蛋白质等）在冻融后会显著降解，使以前可重复的结果变得不可能。在这种情况下，我们通常建议客户准备和测试新鲜样品。
在裂解细胞或组织时，选择合适的裂解缓冲液也很重要。常见的RIPA裂解缓冲液应用广泛，但对于膜蛋白或核蛋白，我们建议使用专门设计用于提取此类蛋白的方案进行样品制备，以实现靶蛋白的大规模收集。
3、 实验操作不当
小分子蛋白质具有高度可降解性和吸附能力。转移膜时，应使用0.2μm PVDF膜，甲醇浓度应保持在20%，以提高小分子蛋白质在膜上的结合能力。传输条件可以设置为80v/1h，使用较低的电压和适当的传输时间。
对于一些分子量约为10kd的分泌蛋白，这些蛋白在电泳过程中很容易分散，导致抗体无法检测到，从而导致没有信号。小分子蛋白质的实验操作可以在以下条件下进行优化：
配置SDS-PAGE凝胶时，增加浓缩凝胶的比例，使浓缩凝胶与分离凝胶的比例约为4:6，甚至5:5。这可以使小分子蛋白质在浓缩凝胶中完全浓缩，并减少后续分离凝胶实验中的分散。
在电泳过程中，用80V的电压压缩约40分钟，直到达到两种凝胶之间的界面。然后，将电压调节至100V，在12%-15%的分离凝胶中进行电泳。运行到分离凝胶的中途点，只要10kd标记可以分离，以避免长时间电泳导致小分子蛋白质分散。（此时，可能很难检测到内部参考，但为了检测小分子蛋白质，最好运行另一种凝胶来测试内部参考。）
3.转移膜时，不要在转移溶液中加入SDS，以防止小分子蛋白质无法与PVDF膜结合。甲醇的浓度可以增加到30%，以增强小分子蛋白质与膜的结合。
对于10kd左右的蛋白质，转移条件为80v，蛋白质可以在30分钟内转移，最多60分钟。只要标记物成功转移到膜上，相应的分子量就会转移。
在电泳过程中，6%-8%的分离凝胶用于大分子蛋白质。建议在200kd或更长时间后使用6%的分离凝胶。凝胶在膜转移过程中相对较软，应小心处理。同时，有必要将甲醇的浓度降低10%。为了防止蛋白质在凝胶中形成沉淀，可以在膜转化时加入终浓度为0.1%的SDS。条件是80v。根据蛋白质的大小，3h-5h甚至更长的膜转化时间是理想的。对于200kd以上的蛋白质，建议在4℃下将20v转化为O/N，这样可以获得更好的结果。
密封时，延长密封时间可能会因过度密封而导致靶结合抗体的效率降低，膜清洗不应过度，以防止结合蛋白的洗脱。
大包装抗体或长时间储存的抗体可能会因长时间放置而导致甘油分层并漂浮在表面上。稀释抗体时，可能会出现抗体无法被吸收的情况。建议每次立即离心，将甘油离心至试管底部，并使用上层保存液避免这种情况。
